Predmety štúdia rozdelené na:

živé (bunky v kvapke krvi, bunky v kultúre atď.);

mŕtve alebo fixované, ktoré možno odobrať zo živého organizmu (biopsia) aj z mŕtvol.

V každom prípade sa po odbere kúskov podrobia pôsobeniu fixačných roztokov alebo zmrazeniu. Ako vo vedeckej, tak aj vzdelávacie účely používajú sa pevné predmety. Určitým spôsobom pripravené prípravky používané na vyšetrenie pod mikroskopom sa nazývajú histologické prípravky.

Histologický preparát môže byť vo forme: (tenký farebný rez orgánu alebo tkaniva; náter na skle; odtlačok na skle zo zlomeniny orgánu; tenký filmový preparát).

Histologický preparát akejkoľvek formy musí spĺňať tieto požiadavky: (zachovať intravitálny stav štruktúr; byť dostatočne tenký a transparentný, aby sa dal študovať pod mikroskopom v prechádzajúcom svetle; byť kontrastný, to znamená, že skúmané štruktúry musia byť jasne definované pod mikroskopom; na preučenie sa používajú prípravky na svetelnú mikroskopiu.)

Tieto požiadavky sa dosahujú pri príprave liečiva.

Výskumné metódy:

Svetelná mikroskopia-Mikroskopia - hlavná metóda štúdia preparátov - sa v biológii používa už viac ako 300 rokov. ultrafialová mikroskopia- Toto je druh svetelnej mikroskopie. Ultrafialový mikroskop využíva kratšie ultrafialové lúče s vlnovou dĺžkou asi 0,2 µm. Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia- Fenomény fluorescencie spočívajú v tom, že atómy a molekuly množstva látok, ktoré absorbujú lúče s krátkou vlnovou dĺžkou, prechádzajú do excitovaného stavu. Fázová kontrastná mikroskopia- Táto metóda sa používa na získanie kontrastných obrazov priehľadných a bezfarebných predmetov, neviditeľných konvenčnými mikroskopickými metódami. elektrónová mikroskopia-Elektrónový mikroskop využíva prúd elektrónov s kratšími vlnovými dĺžkami ako svetelný mikroskop.

Hlavnými fázami cytologickej a histologickej analýzy sú výber predmetu štúdie, jeho príprava na vyšetrenie pod mikroskopom, použitie mikroskopických metód, ako aj kvalitatívna a kvantitatívna analýza obrázkov.

Najčastejšie sa na štúdium používa časť tkaniva alebo orgánu. Histologické preparáty je možné študovať bez špeciálneho spracovania. Napríklad pripravený krvný náter, výtlačok, film alebo časť orgánu je možné okamžite vidieť pod mikroskopom. Ale vzhľadom na to, že štruktúry majú slabý kontrast, sú v bežnom svetelnom mikroskope zle detekované a je potrebné použitie špeciálnych mikroskopov (fázový kontrast atď.). Preto sa častejšie používajú špeciálne spracované prípravky: fixované, uzavreté v pevnom médiu a farbené.

Proces výroby histologického preparátu pre svetelnú a elektrónovú mikroskopiu zahŕňa tieto hlavné kroky:

1. prevzatie materiálu a jeho upevnenie,

2. zhutňovanie materiálu,

3. príprava sekcií,

4. farbenie alebo kontrastné rezy.

Pre svetelnú mikroskopiu je potrebný ešte jeden krok - uzatváranie rezov v balzame alebo inom priehľadnom médiu.

Fixácia zabraňuje rozkladným procesom, čím pomáha zachovať celistvosť orgánových štruktúr Malá vzorka sa buď ponorí do fixačného prostriedku (alkohol, formalín, roztoky solí ťažké kovy, kyselina osmiová, špeciálne fixačné zmesi), alebo podrobené tepelnému spracovaniu

Zhutňovanie materiálu potrebné na prípravu rezov sa uskutočňuje impregnáciou predtým dehydratovaného materiálu parafínom, celoidínom a organickými živicami. Rýchlejšie zhutnenie sa dosiahne použitím metódy zmrazenia kusov, napríklad v tekutej kyseline uhličitej.

Krájanie prebieha na špeciálnych zariadeniach - mikrotómy(pre svetelnú mikroskopiu) a ultramikrotómy(pre elektrónovú mikroskopiu).

Farbenie rezov (vo svetelnej mikroskopii) alebo ich postriekanie soľami kovov (v elektrónovej mikroskopii) sa používa na zvýšenie kontrastu obrazu jednotlivých štruktúr pri pohľade pod mikroskopom. Metódy farbenia histologických štruktúr sú veľmi rôznorodé a vyberajú sa v závislosti od cieľov štúdie.

Histologické farbivá (podľa ich chemickej povahy) sa delia na kyslé, zásadité a neutrálne.Bežné farbivo hematoxylín, ktorý farbí jadrá buniek do fialova a kyslé farbivo - eozín farbenie cytoplazmy ružovo-žlté. Selektívna afinita štruktúr k určitým farbivám je spôsobená ich chemické zloženie A fyzikálne vlastnosti. Štruktúry, ktoré sa dobre farbia kyslými farbivami, sa nazývajú oxyfilné a tie, ktoré sa farbia zásaditými farbivami, sa nazývajú bazofilné. Napríklad cytoplazma buniek sa najčastejšie farbí oxyfilne a jadrá buniek sa farbia bazofilne.

Štruktúry, ktoré prijímajú kyslé aj zásadité farbivá, sú neutrofilné (heterofilné). Farebné prípravky sa zvyčajne dehydratujú v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou a vyčistia sa v xyléne, benzéne, toluéne alebo niektorých olejoch. Pre dlhodobú konzerváciu sa dehydrovaný histologický rez vloží medzi sklíčko a krycie sklíčko do kanadského balzamu alebo iných látok. Hotový histologický preparát je možné používať na mikroskopické vyšetrenie dlhé roky.

4). Bunka ako štrukturálna a funkčná jednotka tkaniva. Definícia. Celkový plánštruktúra eukaryotických buniek. Biologické bunkové membrány, ich štruktúra, chemické zloženie a hlavné funkcie.

Bunka je elementárna štrukturálna, funkčná a genetická jednotka v zložení všetkých rastlinných a živočíšnych organizmov. Štruktúra eukaryotickej bunky:

Bunky tvoriace tkanivá živočíchov a rastlín sa výrazne líšia tvarom, veľkosťou a vnútornou štruktúrou Bunky všetkých typov obsahujú dve hlavné zložky, ktoré spolu úzko súvisia – cytoplazmu a jadro. Jadro je oddelené od cytoplazmy poréznou membránou a obsahuje jadrovú šťavu, chromatín a jadierko. Polotekutá cytoplazma vypĺňa celú bunku a je preniknutá početnými tubulmi. Vonku je pokrytá cytoplazmatickou membránou.

Vlastné telo bunky a jej obsah sú oddelené od vonkajšie prostredie alebo zo susedných prvkov v mnohobunkových organizmoch plazmatickou membránou. Mimo plazmatickej membrány je bunková membrána alebo stena, ktorá je obzvlášť dobre exprimovaná v rastlinách. Celé vnútro bunky, s výnimkou jadra, sa nazýva cytoplazma. Cytoplazma eukaryotických buniek nie je homogénna v štruktúre a zložení a zahŕňa: hyaloplazmu, membránové a nemembránové zložky. Membránové organely sú prezentované v dvoch variantoch: jednomembránové a dvojmembránové. Medzi prvé patria organely vakuolárneho systému - endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, lyzozómy, peroxizómy a iné špecializované vakuoly, ako aj plazmatická membrána. Medzi dvojmembránové organely patria mitochondrie a plastidy, ako aj bunkové jadro. Medzi nemembránové organely patria ribozómy, bunkové centrum živočíšnych buniek, ako aj prvky cytoskeletu (mikrotubuly a mikrofilamenty).
Pojem hyaloplazma, hlavná plazma alebo cytoplazmatická matrica, označuje veľmi dôležitú časť bunky, jej skutočné vnútorné prostredie. Hyaloplazma je komplexný koloidný systém, ktorý zahŕňa rôzne biopolyméry: proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy atď. Sú v nej lokalizované enzýmy, ktoré sa podieľajú na syntéze aminokyselín, nukleotidov, mastných kyselín a na metabolizme cukrov.Najdôležitejšou úlohou hyaloplazmy je, že toto prostredie spája všetky bunkové štruktúry a zabezpečuje ich vzájomnú chemickú interakciu. Väčšina procesov vnútrobunkového transportu sa uskutočňuje cez hyaloplazmu: prenos aminokyselín, mastných kyselín, nukleotidov a cukrov. V hyaloplazme je konštantný tok iónov do a z plazmatickej membrány, do mitochondrií, jadra a vakuol. hyaloplazma je ukladanie náhradných produktov: glykogén, tuk. V cytosóle sa na tam umiestnených ribozómoch syntetizujú proteíny, ktoré sú transportované do rôznych častí bunky, ako aj všetky proteíny bunkového jadra, väčšina proteínov mitochondrií a plastidov a hlavné proteíny peroxizómov. Štruktúra bunkových membrán.
Spoločným znakom všetkých bunkových membrán (plazmatických, intracelulárnych a membránových organel) je, že sú to tenké (6-10 nm) vrstvy lipoproteínovej povahy (lipidy v komplexe s proteínmi), uzavreté do seba.

Sú tam tri dôležité zásady membránové štruktúry:
Membrány nie sú homogénne. Membrány obklopujúce intracelulárne organely a plazmatická membrána sa líšia zložením Mnohé membránové zložky sú v stave nepretržitého pohybu. Membrána pripomína neustále sa meniacu mozaiku.Zložky membrán sú extrémne asymetrické. Medzi vonkajšou a vnútornou vrstvou membrán je rozdiel v relatívnom množstve a kvalitatívnom zložení lipidov. Proteíny sú asymetricky usporiadané medzi lipidmi a majú dobre definované extra- a intracelulárne oblasti.

Najdôležitejšie funkcie membrány sú nasledovné:

Membrány riadia zloženie vnútrobunkového prostredia.

Membrány zabezpečujú a uľahčujú medzibunkový a intracelulárny prenos informácií.

Membrány zabezpečujú tvorbu tkaniva prostredníctvom medzibunkových kontaktov.

Chemické zloženie bunky.
Bunky živých organizmov sú podobné nielen svojou štruktúrou, ale aj chemickým zložením. Podobnosť v štruktúre a chemickom zložení buniek naznačuje jednotu ich pôvodu.

Podľa zloženia sa látky vstupujúce do bunky delia na organické a anorganické.
1. Anorganické látky.
Voda má v živote bunky veľký význam. Mnohé prvky v bunkách sú obsiahnuté vo forme iónov. Najbežnejšie sú katióny: K+, Na+, Ca2+ Mg2+, a anióny: H2PO4-, Cl-, HCO3-.
Minerálne soli (napríklad fosforečnan vápenatý) môžu byť súčasťou medzibunkovej látky, škrupín mäkkýšov a poskytujú silu týmto formáciám.
2. Organické látky.
Charakteristické len pre živých. Organické zlúčeniny sú v bunke zastúpené jednoduchými malými molekulami (aminokyseliny, mono- a oligosacharidy, mastné kyseliny, dusíkaté zásady) a makromolekulami biopolymérov (bielkoviny, lipidy, polysacharidy, nukleové kyseliny). Molekuly biopolymérov pozostávajú z opakujúcich sa zlúčenín s nízkou molekulovou hmotnosťou (monoméry

Bunkové funkcie. Bunka má rôzne funkcie: delenie buniek, metabolizmus a

V modernej histológii, cytológii a embryológii sa používajú rôzne výskumné metódy na komplexné štúdium procesov vývoja, štruktúry a funkcie buniek, tkanív a orgánov.

Hlavnými fázami cytologickej a histologickej analýzy sú výber predmetu štúdie, jeho príprava na vyšetrenie pod mikroskopom, použitie mikroskopických metód, ako aj kvalitatívna a kvantitatívna analýza obrázkov.

Predmetom štúdia sú živé a mŕtve (fixované) bunky a tkanivá a ich obrazy získané vo svetelných a elektrónových mikroskopoch.

Hlavným predmetom výskumu sú histologické prípravky pripravené z pevných konštrukcií. Droga môže byť namazať(napríklad krvný náter, kostná dreň sliny, cerebrospinálny mok atď.), odtlačok(napr. slezina, týmus, pečeň), film tkanivo (napr. spojivové alebo peritoneálne, pleura, pia mater), tenké plátok. Najčastejšie sa na štúdium používa časť tkaniva alebo orgánu. Histologické preparáty je možné študovať bez špeciálneho spracovania. Napríklad pripravený krvný náter, výtlačok, film alebo časť orgánu je možné okamžite vidieť pod mikroskopom. Ale vzhľadom na to, že štruktúry majú slabý kontrast, sú v bežnom svetelnom mikroskope zle detekované a je potrebné použitie špeciálnych mikroskopov (fázový kontrast atď.). Preto sa častejšie používajú špeciálne spracované prípravky: fixované, uzavreté v pevnom médiu a farbené.

Proces výroby histologického preparátu pre svetelnú a elektrónovú mikroskopiu zahŕňa tieto hlavné kroky:

• 1. prevzatie materiálu a jeho upevnenie,
• 2. zhutňovanie materiálu,
• 3. príprava sekcií,
• 4. farbenie alebo kontrastné rezy.

Pre svetelnú mikroskopiu je potrebný ešte jeden krok - uzatváranie rezov v balzame alebo inom priehľadnom médiu.

Fixácia zabezpečuje prevenciu rozkladných procesov, čo pomáha zachovať celistvosť štruktúr. Dosahuje sa to tak, že malá vzorka odobratá z orgánu sa buď ponorí do fixačného prostriedku (alkohol, formalín, roztoky solí ťažkých kovov, kyselina osminová, špeciálne fixačné zmesi), alebo sa podrobí tepelnému spracovaniu. Pôsobením fixačného prostriedku dochádza v tkanivách a orgánoch k zložitým fyzikálno-chemickým zmenám. Najvýznamnejším z nich je proces ireverzibilnej koagulácie proteínov, v dôsledku čoho prestáva životne dôležitá aktivita a štruktúry sú mŕtve, fixované. Fixácia vedie k zhutneniu a zmenšeniu objemu kusov, ako aj k zlepšeniu následného farbenia buniek a tkanív.

Tuleň Materiál potrebný na prípravu rezov sa vyrába impregnáciou predtým dehydratovaného materiálu parafínom, celoidínom a organickými živicami. Rýchlejšie zhutnenie sa dosiahne použitím metódy zmrazenia kusov, napríklad v tekutej kyseline uhličitej.

Príprava sekcie prebieha na špeciálnych zariadeniach - mikrotómy(pre svetelnú mikroskopiu) a ultramikrotómy(pre elektrónovú mikroskopiu). Pozri odkaz - rezacie zariadenia.

Farbenie plátky (vo svetelnej mikroskopii) alebo ich naprašovanie soľami kovov (v elektrónovej mikroskopii) slúžia na zvýšenie kontrastu obrazu jednotlivých štruktúr pri pohľade pod mikroskopom. Metódy farbenia histologických štruktúr sú veľmi rôznorodé a vyberajú sa v závislosti od cieľov štúdie. Pozri fórum histologické techniky.

Histologické škvrny (podľa ich chemickej povahy) sa delia na kyslé, zásadité a neutrálne. Príkladom je najčastejšie používané farbivo hematoxylín, ktorý farbí jadrá buniek do fialova a kyslé farbivo -- eozín farbenie cytoplazmy ružovo-žlté. Selektívna afinita štruktúr k určitým farbivám je spôsobená ich chemickým zložením a fyzikálnymi vlastnosťami. Štruktúry, ktoré sa dobre farbia kyslými farbivami, sa nazývajú oxyfilný a morené základnými - bazofilné. Napríklad cytoplazma buniek sa najčastejšie farbí oxyfilne a jadrá buniek sa farbia bazofilne.

Štruktúry, ktoré prijímajú kyslé aj zásadité farbivá, sú neutrofilné (heterofilné). Farebné prípravky sa zvyčajne dehydratujú v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou a vyčistia sa v xyléne, benzéne, toluéne alebo niektorých olejoch. Pre dlhodobú konzerváciu sa dehydrovaný histologický rez vloží medzi sklíčko a krycie sklíčko do kanadského balzamu alebo iných látok. Hotový histologický preparát je možné používať na mikroskopické vyšetrenie dlhé roky.

Pre elektrónovú mikroskopiu sa rezy získané na ultramikrotóme umiestnia na špeciálne mriežky, kontrastujú so soľami uránu, olova a iných kovov, potom sa prezerajú pod mikroskopom a fotografujú. Získané mikrofotografie slúžia ako predmet štúdia spolu s histologickými preparátmi.

Histologické metódy výskumu

histologický rez elektrónová mikroskopia bunka

Histochemické metódy

Metódy identifikácie chemikálií v histologických rezoch. Neodmysliteľnou súčasťou G. m. sú cytochemické metódy, ktoré zisťujú chemikálie v bunkách pripravených náterov a odtlačkov. Histochemický výskum je založený na kombinácii princípov a metód chemickej analýzy s princípmi a metódami morfologického štúdia buniek a tkanív využívaných v cytológii a histológii. To poskytuje významné výhody pri štúdiu morfologickej a funkčnej organizácie rastlinných a živočíšnych tkanív, pretože. identifikované Chemická látka môžu byť spojené so špecifickou tkanivovou alebo bunkovou štruktúrou, t.j. nastaviť jeho lokalizáciu. Histochemické metódy sú široko používané v histológii, cytológii, embryológii, patologickej anatómii, experimentálnej a klinickej morfológii. Pomocou rôznych metód modernej histochémie je možné posúdiť vlastnosti fungovania rôznych tkanív a bunkových štruktúr, určiť povahu a rýchlosť metabolických procesov v bunkách a tkanivách a zistiť skoré prejavy choroby.

Nevyhnutnou podmienkou vykonania histochemickej štúdie, najmä pri detekcii enzýmov a iných látok bielkovinovej povahy, je zachovanie štruktúry tkanív a buniek v stave blízkom živému organizmu. To sa dosiahne narezaním čerstvo zmrazeného tkaniva pomocou noža na hlboké chladenie a kryostatu, ako aj sušením mrazom. Niektoré histochemické štúdie, napríklad detekcia sacharidových zlúčenín, sa môžu uskutočniť po špeciálnej fixácii tkanív a zaliatí do parafínu.

Mnohé histochemické štúdie sú skupinové, t.j. sa používajú na detekciu zlúčenín s rovnakými alebo podobnými vlastnosťami. Ostatné G. m. a. sú prísne špecifické a používajú sa na identifikáciu určitých látok. Na detekciu sacharidových zlúčenín sa široko používajú metódy založené na metachromázii - vlastnosť buniek a tkanív farbiť sa vo farbe, ktorá sa líši od farby farbiva. Metachromázia je spôsobená polymerizáciou molekúl farbiva pod vplyvom voľných negatívnych nábojov glykozaminoglykánov (kyslých mukopolysacharidov) prítomných v tkanive.

Histochemické metódy na detekciu enzýmov sú vysoko špecifické. Sú založené na pôsobení enzýmu na špecifický substrát v prítomnosti inej látky, nazývanej zachytávač (akceptor). Akceptor v spojení s primárnym produktom enzymatickej reakcie vytvára nerozpustnú, zvyčajne farebnú zrazeninu - konečný produkt reakcie, ktorá označuje miesto pôsobenia enzýmu. Ako akceptory sa používajú ióny kovov, diazóniové soli a iné zlúčeniny. Kovové ióny majú vysokú elektrónovú hustotu, takže ich možno detegovať elektrónovou mikroskopiou. Táto vlastnosť sa využíva v elektrónovej histochémii. Na stanovenie dehydrogenáz v tkanivovom reze sa používajú tetrazóliové soli, ktoré sa v prítomnosti špecifického substrátu redukujú za vzniku nerozpustných farebných produktov - formazanov. Vyhodnotenie výsledkov histochemických reakcií, založené na selektívnom farbení štruktúr alebo precipitácii farebného reakčného produktu, môže byť pri použití cytospektrofotometrie nielen kvalitatívne, ale aj kvantitatívne. Možné je aj vizuálne semikvantitatívne hodnotenie intenzity farbenia v bodoch.

elektrónová mikroskopia

Elektrónová mikroskopia - súbor metód na štúdium mikroštruktúr telies, ich lokálneho zloženia a lokalizovaných na povrchoch alebo v mikroobjemoch telies elektrických a magnetických polí pomocou elektrónových mikroskopov.

V prvej fáze sa elektrónová mikroskopia používala hlavne na pozorovanie biologických objektov a na interpretáciu obrázkov sa používal iba adsorpčný kontrast. Podoba metódy replík - odtlačkov zhotovených z povrchu a najmä ich zdobenie kovmi (40. - 50. roky 20. storočia) však umožnili úspešne študovať anorganické materiály - úlomky a lomy kryštálov. Približne od začiatku 50. rokov 20. storočia začali intenzívne pokusy študovať tenké fólie materiálov v prenose. Bolo to možné v dôsledku výrazného zvýšenia urýchľovacieho napätia v elektrónových mikroskopoch až na 100 kV. Od tohto obdobia sa začína rýchly rozvoj technológie elektrónovej mikroskopie, elektrónová mikroskopia sa čoraz viac používa vo fyzikálnych materiáloch. Jedným z najdôležitejších dôvodov je zrejme možnosť pozorovať v jednom experimente obraz objektu v reálnom priestore a jeho difrakčný obrazec. Preto je elektrónová mikroskopia najvhodnejšou metódou na štúdium štruktúr zložitých kryštalických objektov.

Elektrónovú mikroskopiu možno rozdeliť do 3 skupín:

- Transmisná elektrónová mikroskopia(Transmisná elektrónová mikroskopia)

TEM je najuniverzálnejšia klasická metóda na štúdium štruktúrnych defektov v kryštáloch, používa sa priamo na analýzu morfologických znakov, orientácie defektov vzhľadom na matricu a určovanie ich veľkosti. Pre prácu na transmisných elektrónových mikroskopoch sú potrebné špeciálne pripravené tenké prípravky - repliky alebo fólie, ktoré sú pre elektróny transparentné. Najbežnejšie elektrónové mikroskopy s urýchľovacím napätím 100 a 200, 300 a 400 kV, pričom študované vzorky by mali mať rôznu hrúbku v závislosti od veľkosti urýchľovacieho napätia (pre 100 kV v prípade kremíka je optimálna hrúbka 0,3 -0,4 μm, pre 200 kV - od 0,6-0,8 μm do 1 μm). Repliky sa používajú na pozorovanie mikroreliéfu, textúry povrchu testovanej vzorky. Samotná replika je tenký film nejakej látky, na ktorej sa získa odtlačok povrchového mikroreliéfu. Toto sa uskutočňuje napríklad naprašovaním uhlíkového filmu alebo nanesením filmu laku alebo želatíny. Metóda repliky umožňuje získať informácie o štruktúre povrchu vzoriek. Fólie sú tenké filmy, ktoré sa získavajú z masívnych vzoriek a riedenie vzorky sa musí vykonávať tak, aby do skúmanej oblasti nevnášalo ďalšie poruchy. Zriedená vzorka, ako aj odstránená replika, sa umiestni na špeciálnu mriežku s veľkými otvormi a umiestni sa do stĺpca mikroskopu. Práve na fóliách sa robí výskum tvorby defektov v kryštáloch.

Vlnová dĺžka 100 keV elektrónov je približne 0,004 nm a rozlíšenie bežného transmisného elektrónového mikroskopu je 0,15 nm. V oblasti defektu je pozorovaná zmena intenzity kontrastu, pretože buď je mriežka v oblasti defektu zdeformovaná, alebo je okolo dislokácií a precipitátov elastické pole napätia. Pri malej deformácii matricovej mriežky nemusí byť defekt zistený. Navyše, keďže pri pozorovaní defektov s hustotou menšou ako 108 cm sa pozoruje malá plocha 3, na zistenie vady je potrebná kontrola Vysoké číslo fólie.

Transmisná elektrónová mikroskopia s vysokým rozlíšením

VREM prakticky nová metóda výskum, umožňuje priamo pozorovať kryštálovú mriežku materiálu – získať obraz jednotlivých rovín kryštálovej mriežky. Najmenšia medziplanárna vzdialenosť, ktorú by bolo možné rozlíšiť pomocou elektrónovej mikroskopie s vysokým rozlíšením, je -0,1-0,2 nm. Znakom HREM je použitie špeciálnej optiky novej generácie a určujúcim faktorom pri tvorbe obrazu nie je difrakcia, ale absorpčný kontrast.

- Skenovacia elektrónová mikroskopia

Použitie rastrového skenovania elektrónového lúča nad povrchom vzorky je jedným zo spôsobov automatizácie meraní. Z hľadiska svojich možností je SEM pokračovaním optickej mikroskopie, ktorá rozširuje jej možnosti pri štúdiu topológie povrchov kryštalických materiálov. Rozlíšenie najbežnejších SEM dosahuje 5-10 nm s hĺbkou ostrosti 0,6-0,8 mm nedosiahnuteľné pre iné typy mikroskopov a pri štúdiu topológie povrchu úplne postačí použiť nízkonapäťové SEM s elektrónovým lúčom. priemer 10 μm. Typicky sa používa elektrónový lúč s energiou 10-30 keV, hoci v niektorých prípadoch možno použiť elektróny s energiou niekoľkých stoviek eV. V SEM je obraz objektu tvorený postupne bodmi a je výsledkom interakcie elektrónového lúča (sondy) s povrchom vzorky. Každý bod vzorky je postupne ožarovaný zaostreným elektrónovým lúčom, ktorý sa pohybuje po skúmanom povrchu, podobne ako skenovanie elektrónového lúča v televíznych systémoch. Keď elektróny sondy interagujú s látkou, vznikajú odozvové signály rôzneho fyzikálneho charakteru, ktoré sa používajú na synchrónne vytváranie obrazu na obrazovke monitora. Na vytvorenie obrazu sa nepoužíva elektrónovo-optický systém, obraz je škálovaný rádiotechnickými prostriedkami. Preto sa rastrovacie elektrónové mikroskopy zásadne líšia od mikroskopov ako difrakčných prístrojov v bežnom zmysle tohto pojmu. SEM je v podstate televízny mikroskop.

ultrafialová mikroskopia

ultrafialová mikroskopia- mikroskopia, pri ktorej je objekt osvetlený ultrafialovými lúčmi a jeho viditeľný obraz sa získava pomocou fluorescenčnej clony alebo mikrofotografie; používa sa na zvýšenie kontrastu obrazu, najmä intracelulárnych štruktúr.

Metóda pozorovania v ultrafialovom (UV) žiarení umožňuje zvýšiť limitné rozlíšenie mikroskopu, t.j. znížiť jeho limitné rozlíšenie, ktoré závisí od vlnovej dĺžky. λ aplikované žiarenie (pre UV lúče používané v mikroskopii A = 400-250 nm, zatiaľ čo pre viditeľné svetlo A = 700-400 nm). Predovšetkým však táto metóda rozširuje možnosti mikroskopických štúdií tým, že častice mnohých látok, ktoré sú priehľadné vo viditeľnom svetle, silne absorbujú UV žiarenie určitých vlnových dĺžok, a preto sú na UV obrazoch ľahko rozlíšiteľné. Charakteristické absorpčné spektrá v UV oblasti vykazuje napríklad množstvo látok obsiahnutých v rastlinných a živočíšnych bunkách (purínové zásady, pyrimidínové zásady, väčšina vitamínov, aromatické aminokyseliny, niektoré lipidy, tyroxín atď.); to viedlo k širokému použitiu UV mikroskopie ako jednej z metód cytochemickej analýzy.

UV lúče sú neviditeľné ľudské oko. Preto sa obrazy v UV mikroskopii zaznamenávajú buď fotograficky alebo pomocou elektrónovo-optického konvertora alebo luminiscenčnej obrazovky. Nasledujúci spôsob farebného znázornenia takýchto obrázkov je rozšírený. Liečivo sa fotografuje v troch vlnových dĺžkach UV oblasti spektra; každý zo získaných negatívov je osvetlený viditeľným svetlom určitej farby (napríklad modrým, zeleným a červeným) a všetky sú súčasne premietané na jedno plátno. V dôsledku toho sa na obrazovke vytvorí farebný obraz objektu v podmienených farbách v závislosti od absorpčnej kapacity liečiva v ultrafialovom svetle.

Fluorescenčná mikroskopia

Metóda výskumu vo svetle luminiscencie (luminiscenčná mikroskopia, resp. fluorescenčná mikroskopia) spočíva v pozorovaní pod mikroskopom zeleno-oranžovej žiary mikroobjektov, ktorá vzniká pri osvetlení modrofialovým svetlom alebo ultrafialovými lúčmi, ktoré nie sú viditeľné. oko. Pri tejto metóde sa do optickej schémy mikroskopu zavedú dva svetelné filtre. Prvý z nich je umiestnený pred kondenzátorom; prepúšťa žiarenie z iluminátora len na tých vlnových dĺžkach, ktoré vybudia luminiscenciu buď samotného objektu (vnútorná luminiscencia), alebo špeciálnych farbív zavedených do prípravku a absorbovaných jeho časticami (sekundárna luminiscencia). Druhý svetelný filter, inštalovaný za šošovkou, prepúšťa do oka pozorovateľa (alebo do fotocitlivej vrstvy) iba luminiscenčné svetlo. Vo fluorescenčnej mikroskopii sa využíva ako osvetlenie preparátov zhora (cez objektív, ktorý v tomto prípade slúži aj ako kondenzor), tak aj zdola cez klasický kondenzor. Pozorovanie pri osvetlení zhora sa niekedy nazýva "luminiscenčná mikroskopia v odrazenom svetle" (tento termín je ľubovoľný - excitácia žiary liečiva nie je jednoduchým odrazom svetla); často sa kombinuje s pozorovaním fázového kontrastu v prechádzajúcom svetle.

Metóda je široko používaná v mikrobiológii, virológii, histológii, cytológii, Potravinársky priemysel, pri štúdiu pôd, pri mikrochemickej analýze, pri zisťovaní chýb. Množstvo a rozmanitosť aplikácií súvisí s extrémne vysokou farebnou citlivosťou oka a vysokým kontrastom obrazu samosvietiaceho objektu na tmavom neluminiscenčnom pozadí, ako aj hodnotou informácií o zložení a vlastnostiach študovaných látok, ktoré možno získať poznaním intenzity a spektrálneho zloženia ich luminiscenčného žiarenia.

Fázová kontrastná mikroskopia

Metóda fázového kontrastu sa používa na získanie obrázkov priehľadných a bezfarebných objektov, ktoré sú neviditeľné pri pozorovaní metódou svetlého poľa. Medzi takéto predmety patria napríklad živé nezafarbené tkanivá zvierat. Metóda je založená na skutočnosti, že aj pri veľmi malých rozdieloch v indexoch lomu rôznych prvkov liečiva prechádza svetelná vlna cez ne rôzne fázové zmeny (získava tzv. fázový reliéf). Tieto fázové zmeny, ktoré nie sú priamo vnímané ani okom, ani fotografickou platňou, sa pomocou špeciálneho optického zariadenia premieňajú na zmeny amplitúdy svetelnej vlny, teda na zmeny jasu („amplitúdový reliéf“). ktoré sú už okom rozlíšiteľné alebo fixované na fotocitlivej vrstve. Inými slovami, vo výslednom viditeľnom obraze distribúcia jasu (amplitúdy) reprodukuje fázový reliéf. Takýto obraz sa nazýva fázový kontrast. V schéme typickej pre túto metódu je v prednom ohnisku kondenzora 3 inštalovaná apertúrna membrána 2, ktorej otvor má tvar prstenca. Jeho obraz sa objaví v blízkosti zadného ohniska šošovky 5 a tzv fázová doska 6, na povrchu ktorej je prstencový výstupok alebo prstencová drážka, nazývaná fázový krúžok. Fázová platňa môže byť tiež umiestnená nie v ohnisku objektívu (často sa fázový krúžok aplikuje priamo na povrch jednej zo šošoviek objektívu), ale v každom prípade lúče z iluminátora 1, ktoré nie sú vychýlené pri príprave 4 , vytvárajúce obraz membrány 2, musia úplne prejsť fázovým prstencom, ktorý ich roj výrazne oslabí (urobí pohlcujúcim) a zmení ich fázu na λ/4 (λ - vlnová dĺžka svetla). Zároveň lúče, dokonca aj mierne vychýlené (rozptýlené) v prípravku, prechádzajú fázovou doskou, obchádzajú fázový kruh (prerušované čiary) a nepodliehajú ďalšiemu fázovému posunu.

Ak vezmeme do úvahy fázový posun v prípravnom materiáli, celkový fázový rozdiel medzi vychýlenými a nevychýlenými lúčmi sa blíži k 0, resp. λ/2, a v dôsledku svetelnej interferencie (pozri svetelnú interferenciu) v 4" obrazovej rovine preparátu 4 sa navzájom výrazne zvýrazňujú alebo zoslabujú, čím vytvárajú kontrastný obraz štruktúry preparátu. Odchýlené lúče majú oveľa nižšiu amplitúdu v porovnaní s nevychýlenými preto útlm hlavného lúča vo fázovom prstenci, ktorý spája hodnoty amplitúd, tiež vedie k väčšiemu kontrastu obrazu.

Metóda umožňuje rozlíšiť malé prvky štruktúry, ktoré sú pri metóde svetlého poľa extrémne slabo kontrastné.

Transparentné častice relatívne malých rozmerov rozptyľujú svetelné lúče pod takými malými uhlami, že tieto lúče prechádzajú fázovým prstencom spolu s nevychýlenými. Pre takéto častice dochádza k efektu fázového kontrastu len v blízkosti ich obrysov, kde dochádza k silnému rozptylu.

Polarizačná mikroskopia

Mikroskopia založená na schopnosti rôznych zložiek buniek a tkanív lámať polarizované lúče. V polarizačnom mikroskope môžete skúmať predmety, ktoré sa vyznačujú dvojlomom.

Rádiová autografia

Metóda na štúdium distribúcie rádioaktívnych látok (izotopov) v skúmanom objekte alebo zlúčeninách. Spočíva v nanesení fotografickej emulzie citlivej na rádioaktívne žiarenie na predmet a získaní odtlačku, ktorý zafixuje polohu rádioaktívnych izotopov.

Kultivácia buniek a tkanív mimo tela

Spôsob udržiavania buniek, tkanivových rezov, orgánov alebo ich častí v životaschopnom stave mimo tela. V 2. poschodí. 19. storočie rozvoj mikrobiológie, predovšetkým lekárskej (potreba izolovať a študovať mikróby spôsobujúce infekčné ochorenia), ako aj odvetvia založené na fermentačných procesoch, viedli k vytvoreniu metód na kultiváciu buniek baktérií, kvasiniek a iných mikroorganizmov, t.j. metódy ich izolácie, pestovania, rozmnožovania a konzervácie v umelých podmienkach. Zloženie tekutých a pevných živných médií, spôsoby zabezpečenia ich sterility, spôsoby pestovania čisté kultúry, pozostávajúce z buniek rovnakého typu atď. K ser. 20. storočie kultivácia mikroorganizmov bola zvládnutá v priemyselnom meradle.

Na začiatku sa robili prvé pokusy s pestovaním živočíšnych buniek a tkanív mimo tela. 20. storočie Ďalšie zdokonaľovanie metódy išlo súbežne s úspechmi cytológie, biochémie, genetiky, embryológie a molekulárnej biológie. Jeho schopnosti sa zvýšili po tom, čo sa naučili získavať izolované bunky z rôznych živočíšnych tkanív (ošetrením špeciálnymi enzýmami, ktoré rozpúšťajú medzibunkovú látku a ničia medzibunkové kontakty) a zistili potrebu rôznych buniek na hormóny, rastové faktory a ďalšie zavedené látky. do umelých živných médií. Zjavné výhody práca s geneticky homogénnymi bunkami a tkanivami za kontrolovaných podmienok mimo tela v porovnaní s výskumom na celých organizmoch urobila z tejto metódy jednu z najuniverzálnejších v biológii. Rovnako plodné sa ukázalo jeho využitie v medicíne a pri riešení množstva problémov. poľnohospodárstvo a biotechnológie.

Bunkové a tkanivové kultúry sa použili na štúdium vzorcov mitózy a počtu bunkových cyklov (delení) v bunkách rôznych typov a v súvislosti s tým na objasnenie „programovania“ procesu starnutia, na štúdium mechanizmov bunkových diferenciácia, tvorba špecializovaných tkanív a orgánov a tiež (pri spoločnej kultivácii) vzájomné ovplyvňovanie buniek rôznych typov. Kultúra rastlinných buniek a tkanív sa objavila neskôr - v roku 1958, ale až o 6 rokov neskôr bolo možné z jednej bunky extrahovanej z koreňa mrkvy vypestovať celú rastlinu s diferencovanými tkanivami a orgánmi v kultivačných podmienkach. Tento smer je široko používaný v chove a biotechnológiách.

Bunkové a tkanivové kultúry umožňujú študovať pre medicínu také dôležité problémy, ako je premena normálnych buniek na bunky nádorové, komplexne študovať ich vlastnosti, citlivosť buniek na fyzikálne a chemické faktory vr. na liečivá, ako aj na stanovenie potenciálnej mutagenity a karcinogenity týchto faktorov, t.j. ich schopnosť spôsobovať mutácie a nádory. Vývoj metód na dlhodobú kultiváciu umožňuje vytvárať banky bunkových línií s určitými genetickými a biologickými vlastnosťami. chemické vlastnosti. Na tomto základe vznikajú metódy kryokonzervácie (z gréckeho „kryos“ – chlad) – uchovanie buniek, tkanív a orgánov v podmienkach hlbokého chladenia na transplantáciu (transplantáciu), ako rezervný genofond vzácnych a ohrozených biologických druhov. , ako aj na iné účely. Z kon. 20. storočie začali vyskakovať nádoby obsahujúce zmrazené kmeňové bunky používané na liečbu širokej škály chorôb a zranení.

Bunkové kultúry tiež slúžia ako vhodné objekty na štúdium tkanivovej inkompatibility a iných imunitných reakcií. Používajú sa pri diagnostike vírusov a na získanie vakcín. Bunková a tkanivová kultúra sa teda využíva na riešenie tak zásadných teoretických problémov (ako je diferenciácia buniek a pod.), ako aj rôznych praktických problémov najmä v oblasti medicíny. Táto metóda je nevyhnutná komponent genetické inžinierstvo, bunkové inžinierstvo, klonovanie a ďalšie oblasti experimentálnej biológie.

Intravitálne sfarbenie

Fenomén zafarbenia tkaniva počas života tela zavedením rôznych farbív do tela. Farbivá musia byť pre telo netoxické a musia mať schopnosť prenikať do tkanív, ako aj zostať v nich určitý čas. Na farbenie sa používajú kyslé alebo zásadité farby.

Výsledky s kyslými farbami , nezávisia ani tak od ich chemického zloženia, ale od stupňa disperzie a pod fyzikálne a chemické vlastnosti. Vysoko disperzné farbivá nespôsobujú farbenie, ale difúzne impregnujú tkanivá a rýchlo sa vylučujú z tela. Na farbenie sa preto používajú najmä koloidné alebo semikoloidné farbivá (Trypanblau, Isamin-blau), lítiumkarmín atď.. Všetky tieto farby sa vyznačujú negatívnym nábojom častíc, pomalou difúziou a nerozpustnosťou v lipoidoch. Kyslé vitálne farbivá po zavedení do tela difúzne impregnujú základnú látku a potom sa farba hromadí v protoplazme určitých buniek tela vo forme zrnitých usadenín. Takto sa farbia len živé bunky (jadrá sa nefarbia). Mŕtve bunky sa farbia veľmi ostro difúzne a farbia sa aj ich jadrá. Preto V. metóda o. Má veľký význam na rozlíšenie živých buniek od mŕtvych. Ďalej pomocou vitálneho farbenia kyslými farbivami je možné vysledovať distribučný proces v tele mnohých látok, ktoré sa ukladajú v tkanivách rovnako ako spomínané farbivá. Patria sem: žlčové pigmenty, koloidné kovy atď. liečivých látok koloidná povaha, lipoidy a tiež zjavne proteínové telieska, potom - rôzne baktérie, rôzne suspendované častice exogénneho pôvodu, niektoré bunkové prvky a produkty ich rozpadu. Hlavným miestom, kde sa kyslé vitálne farby ukladajú v zrnitej forme a kostrou všetkých práve spomínaných látok, sú bunky. Pre farbenie buniek kyslými farbivami je obzvlášť charakteristické, že základné štrukturálne časti bunkovej protoplazmy nie sú nikdy zafarbené. Farebné zrná, ktoré sa objavujú v bunkách, vznikajú v dôsledku vyzrážania farbiva z rozpusteného stavu po jeho preniknutí do buniek. Niektoré vopred vytvorené intracelulárne inklúzie, najmä proteínového charakteru, sú však do určitej miery impregnované aj kyslými farbivami. Pri farbení v bunkách sa farby ladia v granulovanej forme. Mechanizmus tvorby zrniek farby v bunkách sa vysvetľuje inak: podľa jedného pohľadu bunky vykazujú postupné hromadenie farby vo vnútri novovytvorených vakuol, kde dochádza k postupnému znižovaniu disperzie farby a nakoniec k jej strate. a na pôsobení elektrolytov záleží. Iní pripisujú hlavný význam pri tvorbe intracelulárnych zŕn farby adsorpčným javom. Ďalej existujú náznaky, že farbivo preniká do buniek vždy v kombinácii s plazmatickými proteínmi, takže ich obsah v krvi je veľmi dôležitý. Potom v procese V. o. kyslé, ako aj zásadité farby, zrejme zohráva určitú úlohu koncentrácia H-iónov v tkanivách. Okrem ret.-end buniek. systémoch sa granulované usadeniny kyslých životne dôležitých farieb tvoria aj v epiteli stočených tubulov obličiek (cez ktoré sa tieto farby uvoľňujú hlavne), a tiež, aj keď nie u všetkých zvierat, v bunkách pečene. Pri zavedení do tela veľké množstvá pri niektorých vitálnych farbách (napr. Trypanblau) je možné získať zrnité nánosy farby aj v iných bunkových elementoch, najmä v epiteli endodermálneho pôvodu (v. Mollendorff, Hesse, Glazunov atď.), v rôznych bunkách intermediátov tkaniva, v bunkách mnohých orgánov vnútornej sekrécie, v epiteli cievnych plexusov mozgu atď. Nakoniec sa podarilo získať vitálne farbenie kyslými farbivami a prvkami centrálnej nervový systém(Rakhmanov, Behnsen, Mandelstam a ďalší). Vo všeobecnosti je výsledok intravitálneho farbenia okrem vlastností farbiva ovplyvnený aj spôsobom podávania farbiva, jeho dávkovaním a napokon aj stavom samotných tkanív, najmä stupňom ich prekrvenia. . Pri intravenóznych injekciách nejedovatých kyslých farbív sa dosiahli zaujímavé výsledky a vysledovala sa rýchlosť ich vymiznutia z krvi (Okunev, Seyderhelm) a ich ďalší osud v organizme (Aničkov, Teplov, Kagan). Pri difúznej distribúcii farbiva v tkanivách sú steny ciev obzvlášť ostro difúzne zafarbené (Petrov). Pri subkutánnom a intraperitoneálnom podaní kyslých životne dôležitých farbív bolo tiež možné dosiahnuť, ale pomalšie, celkové sfarbenie zvierat. V tomto prípade sú prvky tkanív obzvlášť ostro zafarbené v mieste vpichu farby. Existujú náznaky, že retikulárny aparát buniek (Golgi) zohráva dôležitú úlohu pri ukladaní zŕn farby v bunkách, pretože vzhľad zŕn sa vždy vyskytuje najskôr v oblasti tohto aparátu (pracujú Nasonov, Khlopin, Yasvoin). Predtým vyjadrené názory, že pri farbení kyslými farbami sú v kôre zafarbené zložky bunkovej protoplazmy, napríklad mitochondrie (Chashin, Stek-kelmacher), v čase b. hod.. - Okrem zavádzania kyslých životne dôležitých farbív do organizmu je dôležitá metóda kultivácie tkanív v plazme s obsahom týchto farbív, najmä Trypanblau (Hofmann, Maksimov, Vetteri, Khlopin). Zároveň je možné pozorovať V. o. bunky a študovať ich v živom stave. - Dôležitá je napokon aj výskumná metóda využívajúca intravitálne farbenie živých tkanív priamo pod mikroskopom, ako to bolo možné na niektorých objektoch (pľúca, močového mechúra , mezentéria obojživelníkov) a možno použiť aj silné imerzné šošovky (diela Garmus "a, Von-willer" a, Venslav). Celoživotné sfarbenie embryonálnych tkanív zavedením kyslých farbív do tela matky nie je pozorované, pretože placenta neumožňuje prechod farbív z krvi matky. Na farbenie tkanív embryí sa používa zavedenie farbív do dutiny amniónu alebo u vtákov injekcia, napríklad do steny alontois. Koloidné farbenie Kongorot je špeciálne navrhnuté na voliteľné farbenie amyloidu in vivo (Bennhold); avšak farba Trypanblau (Herzenberg) dáva rovnaké výsledky. Trochu odlišné je použitie vitálnych farieb pre V. o. kosti. Medzi takéto farby patria deriváty krapp, ktorých sfarbením začiatkom je alizarín. Farbenie kostí je založené na tvorbe alizarínovej zlúčeniny s vápnikom a farbia sa len mladé rastúce kosti (Lieberkuhn, Fischel, Gottlieb). Nek-ry produkty, ktoré sa tvoria v organizme v patovej situácii. Zmeny Hb dávajú rovnakú farbu kostí ako alizarín. Patrí sem hematoporfyrín, ktorý sa pri nadmernej tvorbe v organizme ukladá v kostiach a farbí celú kostru do ostrej hnedej farby (E. Fraenkel). Trochu zvláštnou metódou intravitálneho farbenia je tzv. vitálna chemoskopia podľa Karczaga. Táto metóda je založená na schopnosti mnohých farieb trifenylmetánovej skupiny (napríklad kyslý fuchsín, LieMgrim, Wasser-blau) pod vplyvom určitých vplyvov (napríklad svetla, tepla, redukčných látok a pod.) prechádzať do bezfarebné karbinolové zlúčeniny. Po vstreknutí týchto farbív sa vyšetrujú rôzne tkanivá a pôsobením kyseliny sa v nich odhalí farbivo, ktoré farbivo „regeneruje“. V. o. základné farby. Na rozdiel od kyslých škvŕn, zásadité škvrny farbia už existujúce štrukturálne zložky buniek. Predpokladajme, že súčasne dochádza k sedimentácii farby kyslými koloidmi buniek (v. Mollendorff). K prudkému usadzovaniu farby dochádza najmä pri jej úplnom zneutralizovaní prebytkom farby alebo kyslým koloidom, získajú sa rôzne farebné odtiene farebných prvkov, na ktorých sú založené určité metódy stanovenia koncentrácie H-iónov v bunkách. Zásadité farbivá zvyčajne prenikajú do buniek rýchlejšie a zrážajú sa rýchlejšie ako kyslé. Farbením štruktúrnych komponentov buniek dávajú rovnaké výsledky na živých a živých objektoch. Preto ich nemožno plne použiť na rozlíšenie živých buniek od umierajúcich buniek v takej miere ako kyslé farby. Vo všeobecnosti pre vznik V. o. Pre základné farby sú dôležité tieto podmienky: difúzna schopnosť farieb, rýchlosť farbenia, rozpustnosť v lipoidoch, schopnosť obnovy farby, vyzrážanie kyslými koloidmi a napokon obsah H-iónov v tkanivách závisí od roj. Osobitný význam sa pripisoval rozpustnosti zásaditých farbív v lipoidoch. Rýchlosť objavenia sa farby do značnej miery závisela od tejto vlastnosti, pretože uľahčuje penetráciu farby do bunky cez povrchovú lipoidnú vrstvu (Overton, Hober, Nierenstein). Keď sa však ukázalo, že do buniek prenikajú aj farbivá nerozpustné v lipoidoch, teraz naznačený pohľad bol silne otrasený. Spolu s fyzikálnou permeabilitou buniek bol predložený pohľad na ich špeciálnu fyziologickú permeabilitu (Hbher). V súčasnosti sa význam lipoidných zložiek bunky javí v novom svetle v zmysle možnosti akumulácie farby na lipoidno-protoplazmatickom reze, vďaka schopnosti farieb znižovať povrchové napätie na tomto úseku (Okunev) . Moment brániaci V. vynoreniu jazera. základných náterových hmôt, je vlastnosťou posledne menovaných prechádzať obnovou v tkanivách na bezfarebné zlúčeniny. Táto vlastnosť farieb sa využíva aj na určenie miest najväčšej spotreby kyslíka v tkanivách (Ehrlich, Unna a pod.). Základnými časťami buniek vitálne zafarbených základnými farbami sú predovšetkým rôzne inklúzie. V tomto smere je účinok základných farieb čiastočne podobný účinkom kyslých. Ďalej, sekrečné zrná, žĺtkové doštičky, Nisslevova zrnitosť v nervových bunkách, tráviace vakuoly v prvokoch atď., sú zafarbené základnými farbami počas svojho života. arr., tiež na sekrečné zrná a inklúzie. Pôsobením určitých základných farieb (Janusgri "m) je však možné, najmä v tkanivových kultúrach, získať plastozomálne sfarbenie. Základné vitálne farby teda stále farbia najmä paraplastické látky, t.j. Z najbežnejšie používaných základných farieb pre V.O. by sme mali menovať Neutral-rot, Nilblausulfat, Methylenblau, Toluidin-falau, Thionin, Bismarekbraun, Krystallvio-iett atď. Všetky tieto farby sa bežne používajú vo vysoko zriedených roztokoch Neutral-rot, Nilblausulfat a Methylenblau poskytujú obzvlášť dobré výsledky (pre početné výsledky základného farbenia rôznych zvierat, počnúc prvokmi, porov. v dielach Nierensteina „a, Vonwillera“ a, Lomana „a, Stelanského, Fischela“ H, Khlopina atď.). Je veľmi ťažké v mnohých prípadoch rozlíšiť, či sfarbenie ktorejkoľvek základnej farby má vitálny alebo nadživotný charakter. Zvyčajne je supravitálne zafarbenie ostrejšie a zafarbené sú aj štruktúrne prvky jadier. Ehrlichovo farbenie (nesprávne nazývané „vitálne“) nervových vlákien a zakončení podľa Ehrlicha sa považuje za predstaviteľa supravitálneho farbenia (podrobnejšie o tejto metóde pozri v prácach Dogela a jeho školy). Štúdium tkanív pri farbení základnými farbami sa zvyčajne vykonáva bez fixácie, na tkanivových štrbinách alebo na priehľadných membránach, najmä u studenokrvných zvierat (pozri práce Garmus "a, Vonwiller" a, Venslav). Ďalej sa používa aj metóda pestovania tkanív na plazme s prídavkom zásaditých farbív vo veľmi slabých riedeniach (pozri práce Vetter "a, R. Erdmann" a, Khlopin). Pokusy opraviť hlavné farby v tkaninách nedali dobré výsledky. Osobitnú zmienku si zaslúži intravitálne sfarbenie tuku, na ktoré sa používa, Ch. arr., farba Sudán III. Ten sa podáva v roztoku v zeleninový olej cez žalúdok alebo ho zmiešať vo forme prášku s jedlom. Výsledkom je farba všetkých tukových zásob tela. Mechanizmus distribúcie farby a jej prenikania do tukových zásob je stále nedostatočne pochopený (pozri práce JakobsthaFfla, M. B. Schmidta „a a i.).

Metódy výskumu v histológii, cytológii a embryológii I. časť

Štátna lekárska akadémia Ivanovo
Ústav histológie, embryológie a cytológie
Metódy výskumu v
histológia, cytológia a
embryológia
Časť I
Kandidát lekárskych vied, odborný asistent M.R. Grinev
Doktor lekárskych vied, profesor S.Yu. Vinogradov
Doktor lekárskych vied, profesor S.V. Dindiajev
viacÚvod
Metódy štúdia živých buniek a tkanív
Typy histologických preparátov fixovaných buniek
Výroba histologického preparátu
Histologická príprava
Odber materiálu
Fixácia materiálu
Zhutnenie materiálu
Príprava sekcie
Typy mikrotómov
Farbenie sekcií
metódy farbenia
Druhy farbív
Záver rezov v konzervačnom médiu
Mikroskopické metódy
Svetelná mikroskopia
Zariadenie svetelného mikroskopu
Mikroskopická technika
Mikroskopia v tmavom poli
Polarizačná mikroskopia
Fázová kontrastná mikroskopia
Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia
elektrónová mikroskopia
Odporúčané čítanie
späť
Ďalej

Úvod

V modernej histológii, cytológii a embryológii
celý rad výskumných metód, ktoré umožňujú komplexné štúdium
procesy vývoja, štruktúry a funkcie buniek, tkanív a orgánov.
Hlavnými štádiami cytologickej a histologickej analýzy sú
výber predmetu štúdia
príprava na mikroskopiu
aplikácia mikroskopických metód
kvalitatívna a kvantitatívna analýza obrazu
Objekty
výskumu
slúžiť
histologické
vyrobené zo živých alebo fixných buniek.
drogy,
obsah ďalej

Metódy štúdia živých buniek a tkanív

Štúdium živých buniek a tkanív vám umožňuje získať čo najkompletnejšie
informácie o ich životne dôležitej činnosti - sledovať procesy pohybu,
delenie, deštrukcia, rast, diferenciácia a interakcia buniek,
trvanie ich bunkového cyklu, reaktívne zmeny v reakcii na
pôsobenie rôznych faktorov.
Metódy
život
v tele (in vivo)
Implantácia priehľadných komôr
In vivo mikroskopia
Transplantácia
Celý život v kultúre
bunky a tkanivá (in vitro)
Suspenzné kultúry
jednovrstvové kultúry
Kultivácia in vivo
späť
obsah ďalej

Typy histologických preparátov fixovaných buniek

plátok
tenký (hrúbka
viac ako 1 µm)
polotenký
(hrúbka menšia ako
1 µm)
Ultra tenký
(hrúbka menšia ako
0,1 µm)
Namazať
krvi
červená
kosť
mozog
chrbtice
kvapaliny
sliny
vaginálny
atď.
odtlačok
slezina
týmusu
pečeň
hlienovitá
škrupiny
močových
bublina
hlienovitá
škrupiny
líca
atď.
späť
Film
pobrušnice
pleura
mäkký cerebrálny
škrupiny
spojovacie
tkaniny
atď.
obsah ďalej

Výroba histologického preparátu

späť
obsah ďalej

Histologická príprava

Histologické prípravky sú spravidla rezy (hrubé
5-15 µm) orgánov, tkanív alebo buniek zafarbených špeciálnym histologickým
farbivá.
Histologický preparát musí spĺňať tieto požiadavky:
zachovať vitálny stav štruktúr;
byť dostatočne tenké a priehľadné, aby sa dali študovať
mikroskop v prechádzajúcom svetle;
byť naopak, to znamená, že skúmané štruktúry by mali byť pod
jasne definované mikroskopom;
prípravky na svetelnú mikroskopiu treba dlhodobo skladovať a
použiť na preučenie.
Výrobný proces histologickej vzorky zahŕňa nasledujúce
hlavné etapy:
1. Prevzatie a upevnenie materiálu
2. Utesnite materiál
3. Delenie
4. Farbenie rezov
5. Uzavretie sekcií v priehľadnom médiu
späť obsah ďalej

Odber materiálu

Výroba histologického preparátu sa vyrába z orgánov a tkanív,
prijaté niekoľkými spôsobmi:
biopsia (punkcia),
operačný spôsob,
prierezový (mŕtvolný) materiál,
experimentálne
Pritom je potrebné vziať do úvahy nasledujúce body:
1. Odber vzoriek materiálu by sa mal vykonať čo najskôr po smrti
alebo zabitie pokusného zvieraťa, a ak je to možné, zo živého
objekt (biopsia) za účelom lepšieho zachovania štruktúr bunky, tkaniva resp
organ.
2. Odber vzoriek kusov by sa mal robiť ostrým nástrojom, aby sa tak nestalo
poraniť tkanivá.
3. Hrúbka kusu by nemala presiahnuť 5 mm, aby upevnenie
roztok by mohol preniknúť do hrúbky kusu.
4. Povinné
vyrobené
značenie
kus
(uvedené
názov orgánu, číslo zvieraťa alebo meno osoby, dátum
plot a pod.).
späť obsah ďalej

Fixácia materiálu

Účelom materiálnej fixácie je zachovať intravitálnu morfológiu
bunky a tkanivá, čím sa zabráni autolýze a posmrtným zmenám.
Fixátor spôsobuje denaturáciu bielkovín a stabilizáciu lipidov a
tým pozastavuje metabolické procesy a zachováva štruktúry v nich
životný stav.
Fixácia sa dosahuje najčastejšie ponorením dielu do fixačných prostriedkov.
tekutiny, ktoré môžu byť jednoduché (formalín, alkoholy, glutaric
aldehyd, acetón) a komplex (Carnoyov roztok, Zenkerov fixátor atď.).
Fixáciu je možné dosiahnuť aj zmrazením (chladenie v prúde
CO2, kvapalný dusík atď.).
Výber fixátorov a dĺžka fixácie je individuálna pre
rôznych orgánov a tkanív a zvyčajne sa pohybuje od 2 do 24 hodín.
späť obsah ďalej

Zhutnenie materiálu

Účelom tejto etapy je dať študovanému materiálu napr
hustota, ktorá vám umožní získať tenké rezy požadovanej hrúbky.
To sa dosiahne dvoma spôsobmi:
Zmrazenie vzorky, po ktorom nasleduje rezanie na zmrazení
mikrotómu.
Impregnácia tesniacimi prostriedkami (parafín, epoxidové živice atď.)
Hlavné fázy parafínového vedenia:
Opláchnite materiál tečúcou vodou z vodovodu, aby ste ho odstránili
západka.
Zvyšujúca sa dehydratácia (dehydratácia) materiálu v alkoholoch
koncentrácie (70, 80, 90, 96, absolútne - 100 %).
Odstránenie alkoholu a príprava materiálu na impregnáciu parafínom
ošetrenie parafínovými rozpúšťadlami (xylén a pod.) a zmesou parafínu a
xylén (pri 37 °C)
Zaliatie do čistého roztaveného parafínu (pri 56°C).
Chladenie parafínu a tvorba blokov.
späť obsah ďalej

Príprava sekcie

Na výrobu tenkých profilov danej hrúbky v súčasnosti
používajú sa špeciálne prístroje - mikrotómy (pre svetelnú mikroskopiu)
a ultramikrotómy (pre elektrónovú mikroskopiu).
Špeciálne mikrotomové nože umožňujú získať rezy s hrúbkou:
3-8 mikrónov z materiálu zaliateho v parafíne,
10-25 µm z materiálu zmrazeného v komore mikrotómu-kryostatu
0,08-0,1 µm z materiálu pripraveného pre elektrónovú mikroskopiu
Výsledné rezy sa umiestnia na podložné sklíčka (pre svetlo
mikroskopia) alebo namontované na špeciálnych mriežkach (pre elektronické
mikroskopia).
späť obsah ďalej

Typy mikrotómov

tobogán
rotačné
kryostat
zmrazenie
pre expresnú diagnostiku,
histochémia
vibrotóm
výroby
parafín
plátky
výroby
sériový
parafín
plátky
výroby
plátky na
teplota
-20°С a menej
pre histochémiu
a imunocytochémiu
výroby
plátky pevné a
voľné tkanivá
späť obsah ďalej

Farbenie sekcií

Bunkový
štruktúry
bez
špeciálne
spracovanie,
Ako
pravidlo
nie
viditeľné aj pri veľkom zväčšení mikroskopu. Sú bezfarebné a
transparentný.
Na detekciu zložiek tkaniva, jednotlivých buniek, intracelulárne
štruktúry využívajú farbivá – látky s vysokou afinitou k rôznym
látkových komponentov a s určitými farebno-optickými vlastnosťami.
Schopnosť tkanivových komponentov farbiť sa odlišne závisí od
acidobázické (alkalické) vlastnosti látok zahrnutých v ich zložení.
Pred farbením sa rezy postupne zbavia parafínu
cez rozpúšťadlový parafín (xylén), alkoholy klesajúcej koncentrácie (100,
96, 90, 80, 70 %) a umiestnili sa do vody.
späť obsah ďalej

metódy farbenia

Všeobecné histologické
Špeciálne
Histochemický
detekcia
všeobecný plán
budov
bunky, tkanivá,
telá
detekcia
špecializovaný
štruktúry v
bunky a
tkanív
analýza
chemický
zloženie buniek
A
medzibunkový
látok
späť
impregnácia
detekcia
špecializovaný
štruktúry v
bunky a
tkanív
obsah
Ďalej

impregnácia

Spôsob detekcie tkanivových štruktúr impregnáciou predmetov
histologické vyšetrenie s roztokmi ťažkých a vzácnych solí
kovy (napríklad dusičnan strieborný (strieborné pokovovanie), kobalt, chlorid
zlato (pozlátenie), kadmium, anhydrid osmia atď.).
Oblasti tkaniva, na ktorých sa ukladajú kovové soli
histologické štruktúry, získavajú čiernu alebo hnedú farbu v
v závislosti od množstva a vlastností redukovaného kovu.
periférny nerv
(prierez).
Oxidová impregnácia
osmium
Multipolárny neurón.
Impregnácia dusičnanom strieborným
multipolárne neuróny.
Impregnácia dusičnanom strieborným
späť obsah ďalej

Typy všeobecných histologických škvŕn

Hlavná
dôvody,
kontaktovanie
kyslý
zlúčeniny
histologické
štruktúry, príčina
zvyčajne oni
modrofialové farbenie
bazofília
metachromázia
neutrálny
kyslé
obsahujú oboje
základné a
kyslé sfarbenie
Komponenty
spojenie s
Hlavná
(alkalický)
zlúčeniny
histologické
štruktúry,
vyfarbite ich
farbiace farby
neutrofília
oxyfília
späť
obsah ďalej

bazofília

Zásadité (alkalické) farbivá sa aktívne viažu na štruktúry, ktoré
obsahujú kyseliny a nesú negatívny náboj - napríklad DNA, RNA.
Patria sem najmä hematoxylín, toluidínová modrá, tionín,
metylénová modrá, azúrová atď.
Schopnosť farbiť zásaditými (alkalickými) farbivami je tzv
bazofília (z gréc. základ - základ a philia - láska).
Preto sa štruktúry, ktoré viažu tieto farbivá, nazývajú bazofilné.
V bunke má jadro bazofíliu (kvôli vysokému obsahu DNA a RNA),
niekedy cytoplazma vysoký obsah má ribozómy alebo granulovaný ER).
Medzibunková látka niektorých tkanív môže byť zafarbená bazofilne – napr.
chrupkový.
Základná bazofília
neutrofilný granulocyt.

Zväčšenie: x630.
späť
obsah ďalej

Metachromázia

Metachromasia (z gréčtiny meta - zmena a chroma - farba, farba) - zmena farby
niektoré základné farbivá, keď sú viazané na štruktúry, ktoré majú
špecifické chemické vlastnosti (zvyčajne vysoká koncentrácia
sulfátované glykozaminoglykány).
Medzi tieto farbivá patrí toluidínová modrá, azúrová II, tionín atď.
Schopnosť farbiť sa metachromaticky majú granule bazofilov
leukocyty, žírne bunky.
Tieto farbivá farbia iné bazofilné štruktúry v rovnakých tkanivách
ich obvyklú farbu, t.j. ortochromaticky (z gréckeho orthos - správne a
chroma - farba).
Metachromasia granulosa
bazofilný granulocyt.
Farbenie podľa Romanovského-Giemsa.
Zväčšenie: x630.
späť obsah ďalej

Oxyfília

Kyslé farbivá sa viažu na štruktúry, ktoré majú kladný náboj -
napríklad bielkoviny.
Medzi tieto farbivá patrí eozín, pomaranč G, erytrozín, kyselina pikrová atď.
Schopnosť farbiť sa kyslými farbivami sa nazýva oxyfília, príp
acidofília (z gréckeho oxys alebo latinského acidus - kyslý a grécky philia - láska).
Prepojenie štruktúr
acidofilný.
títo
farbivá,
volal
oxyfilný
alebo
Oxyfília je charakteristická pre cytoplazmu buniek (najmä s vysokým obsahom v
mitochondrie a niektoré proteínové sekrečné granuly), erytrocyty (v dôsledku
vysoká koncentrácia hemoglobínu). Cytoplazma zafarbená oxyfilne
kardiomyocyty, svalové vlákna kostrových svalov, niektoré zložky
medzibunková látka (napríklad kolagénové vlákna).
Oxyfília drť
eozinofilný granulocyt.
Farbenie podľa Romanovského-Giemsa.
Zväčšenie: x630.
späť
obsah ďalej

Neutrofília

Neutrofília
(od
lat.
neutrum
–
ani jedno
to,
ani jedno
ďalší,
A
fília - predispozícia, láska) - schopnosť histologických štruktúr
farbené kyslými aj zásaditými farbivami.
Neutrofília granulózna
neutrofilný granulocyt.
Farbenie podľa Romanovského-Giemsa.
Zväčšenie: x630.
späť
obsah ďalej

Záver rezov v konzervačnom médiu

Farbené histologické preparáty sa dehydrujú v alkoholoch
vzostupná koncentrácia (70, 80, 90, 96, absolútna - 100 %) a
čírené v xyléne, benzéne, toluéne alebo niektorých olejoch.
Pre dlhodobé skladovanie je dehydrovaná histologická časť priložená
(namontované) v priehľadnom konzervačnom médiu (živica z ihličnatých stromov -
kanadský, jedľový balzam, ako aj v syntetických médiách).
Na trvalom histologickom preparáte sa tkanivový rez nachádza na
sklenené podložné sklíčko, prekryté krycím sklíčkom. medzi tabuľami
(predmet a obal) existuje odlievacie médium, ktoré má
index lomu svetelných lúčov, blízky indexu lomu skla.
späť obsah ďalej

Mikroskopické metódy

obsah ďalej

Mikroskopické metódy

Optické
Svetelný
Polarizačné
Darkfield
fázový kontrast
Elektronické
priesvitný
(prenos)
skenovanie
(raster)
fluorescenčné
(luminiscenčné)
späť obsah ďalej

Svetelná mikroskopia

Štúdium histologického preparátu sa uskutočňuje v prechádzajúcom svetle
pomocou svetelného mikroskopu.
Svetelný zdroj je prírodný alebo umelý (rôzne svietidlá). Svetlo
sa zhromažďuje v kondenzátore a potom sa posiela cez prípravok do šošovky.
Okulár tento obraz ďalej zväčšuje.
Kvalita
snímky
(definícia)
určený
povoľný
schopnosť mikroskopu, t.j. minimálna (prípustná) vzdialenosť,
na ktorých optika mikroskopu umožňuje rozlíšiť oddelene dva tesne
umiestnené body. Táto hodnota je úmerná vlnovej dĺžke svetla a
pre bežný svetelný mikroskop je približne 0,2 µm.
Čím menšia je vzdialenosť rozlíšenia, tým vyššie je rozlíšenie
mikroskop a možno skúmať aj menšie predmety.
Zväčšenie mikroskopu je pomer medzi skutočnými veľkosťami
skúmaného objektu a veľkosť jeho obrazu získaného pomocou
mikroskop. Zhruba sa to odhaduje ako súčin zväčšení
šošovky a okuláru a môže dosiahnuť 2500-krát.
späť obsah ďalej

Zariadenie svetelného mikroskopu

4
3
5
2
6
7
8
1
12
11
10
9
základňa mikroskopu
držiak trubice
trubica
Okulár (zvyčajne ×7)
mikroskopový revolver
Objektívy
a) suché: ×8, ×20, ×40
b) ponorenie × 90
7. Predmetová tabuľka
8. Kondenzátor
9. Skrutka makrometra
10.Mikrometrová skrutka
11.Skrutka kondenzátora
12.Zrkadlo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Celkové zväčšenie mikroskopu = zväčšenie objektívu × zväčšenie okuláru
späť
obsah ďalej

Mikroskopická technika

1. Mikroskopia histologického preparátu začína inštaláciou správneho
osvetlenie. Na tento účel použite konkávne zrkadlo, ktoré zhromažďuje rozptýlený lúč
svetlo a kondenzor dosahujú rovnomerné osvetlenie zorného poľa.
2. Histologický preparát položte na stôl na predmety krycím sklíčkom nahor.
3. Štúdium histologického preparátu začína pri malom zväčšení (objektív x8), s
V tomto prípade by vzdialenosť medzi objektívom a krycím sklíčkom mala byť približne 1 cm.
Ostrenie sa vykonáva pomocou makro skrutky.
4. Zvážte detaily histologického preparátu po celej ploche a presuňte ho do
predmetová tabuľka.
5. Do stredu zorného poľa nastavte oblasť histologického preparátu, ktorá by mala byť
štúdium pri veľkom zväčšení (objektív x40).
6. Pomocou revolvera sa umiestni šošovka so silnejším zväčšením
(x40). Ostrenie sa vykonáva pomocou mikroskrutky.
7. Na štúdium veľmi malých histologických štruktúr sa používa ponorenie
objektív (x90).
Na krycie sklo prípravku sa nanesie kvapka imerzného oleja.
Opatrne spúšťajte tubus, kým sa šošovka objektívu nedotkne oleja.
Ostrenie sa vykonáva pomocou mikroskrutky.
Po ukončení práce sa zo šošovky a krycieho sklíčka odstráni imerzný olej.
gázové sklo.
späť obsah ďalej

Mikroskopická technika (príklady)

Bud.
Farbivo: hematoxylín-eozín.
Zväčšenie: x 56
(malé zväčšenie).
Bud.
Farbivo: hematoxylín-eozín.
Zväčšenie: x 280
(vysoké zväčšenie).
Bud.
Farbivo: hematoxylín-eozín.
Zväčšenie: x 630
späť
(ponorenie
zvýšiť).
obsah ďalej

Mikroskopia v tmavom poli

Na základe použitia špeciálneho kondenzora, ktorý svieti
liek so "šikmými" lúčmi, ktoré nespadajú do šošovky.
Keď je v zornom poli nejaký predmet, svetlo sa od neho odráža a
nasmerované k objektívu.
Metóda sa často používa na štúdium živých nezafarbených buniek.
späť
obsah ďalej

Polarizačná mikroskopia

Umožňuje odhaliť dvojlom - anizotropiu.
Na predmet skúmania smeruje polarizovaný lúč svetla, t.j. lúče svetla
nasmerované presne v tej istej rovine.
To zabezpečuje špeciálny filter – polarizátor. Toto svetlo je nasmerované na objekt.
výskumu.
Druhý filter - analyzátor je umiestnený medzi objektívom a okulárom a umožňuje
registrovať uhol odchýlky roviny polarizácie svetla.
Mikroskopia umožňuje registrovať priestorové usporiadanie molekúl v
šošovkové alebo kryštalické štruktúry.
oxalátové kryštály.
Polarizačné
mikroskopia.
Priblíženie x 100
späť obsah ďalej

Fázová kontrastná mikroskopia

Metóda sa používa na získanie kontrastných obrazov priehľadných a bezfarebných predmetov, v
najmä umožňuje študovať živé nefarbené prípravky.
Dokonca aj s veľmi malými rozdielmi v indexoch lomu rôznych prvkov lieku
svetelná vlna prechádzajúca cez ne prechádza rôznymi fázovými zmenami (získava
fázová úľava). Tieto fázové zmeny, ktoré oko nevníma, sa transformujú pomocou
špeciálne optické zariadenie (prstencová membrána v kondenzátore a fázová doska v
šošovka) na zmeny amplitúdy svetelnej vlny, t. j. na zmeny jasu („amplitúda
reliéf"), ktoré sú už rozlíšiteľné okom.
Inými slovami, vo výslednom viditeľnom obrázku je rozdelenie jasu (amplitúdy)
reprodukuje fázový reliéf. Výsledný obraz sa nazýva fázový kontrast.
Pseudotrichonympha grassi.
Nešpinený prípravok.
Fázový kontrast
Potkanie semenníky.
Nešpinený prípravok.
Fázový kontrast
Potkanie semenníky.
Farbivo: hematoxylín-eozín
Svetelná mikroskopia
späť obsah ďalej

Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia

Využíva princíp rozžiarenia predmetu štúdia, keď je osvetlený
ultrafialové lúče. Svetelným zdrojom je špeciálna lampa.
Existuje autofluorescencia - vlastná alebo primárna
fluorescencia. Napríklad žiara elastických vlákien v stene tepien.
Sekundárna fluorescencia nastáva po liečbe liekom
špeciálne farbivá - fluorochrómy (akridínová oranž, rodamín,
fluoresceín atď.).
Napríklad: po ošetrení akridínovým pomarančom v klietke veľmi jasne
deteguje sa jadrová DNA (svetlo zelená žiara) a RNA (svetlo červená).
žiara). Po fixácii tkaniva vo formaldehydových parách (Falck metóda)
je nájdený
svetlozelená
žiara
serotonín,
katecholamíny
(adrenalín, norepinefrín).
Ak sa fluorescenčné farbivá viažu na špecifické protilátky
– bude možné identifikovať ich antigény. Táto metóda sa nazýva
imunocytochemické.
späť obsah ďalej

Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia (príklady)

.
.
.
.
eukaryotický cytoskelet
(hovädzie endotelové bunky).
Imunocytochemická metóda
farbenie.
aktínové mikrofilamenty
maľované na červeno,
mikrotubuly - v zelenom, jadrá
bunky sú modré.
Nukleové kyseliny
v maternicovom epiteli
žľazy.
Farbenie akridínom
oranžová.
Jadrová DNA je zafarbená
zelená farba,
RNA je v červenej farbe.
späť
Sympatický
nervových plexusov.
Falkova metóda
obsah ďalej

elektrónová mikroskopia

Elektrónový mikroskop je zariadenie, ktoré vám umožňuje získať obraz predmetov pomocou
maximálne zväčšenie až 106-krát. To bolo možné vďaka použitiu
namiesto svetelného toku elektrónového lúča, ktorého vlnová dĺžka je mnohonásobne kratšia
vlnová dĺžka fotónov viditeľného svetla.
Elektrónový mikroskop pozostáva z elektrónovej pištole (zariadenia na získanie
zväzok elektrónov) a systém elektromagnetických šošoviek umiestnených v stĺpci
mikroskop vo vákuu.
Rozlíšenie elektrónového mikroskopu je 1000÷10000 krát väčšie ako
rozlíšenie svetelného mikroskopu a pre najlepšie moderné prístroje dokážu
byť menšia ako 0,1 nm (10-10 m).
Existovať
dva
Hlavná
odrody
elektronické
prenos (priesvitný) a skenovanie (raster).
späť
mikroskopia:
obsah ďalej

Transmisná (transmisná) elektrónová mikroskopia

Princíp činnosti transmisného elektrónového mikroskopu je ten
elektróny prechádzajúce cez objekt nachádzajúci sa v blízkosti šošovky objektívu,
interagujú s jeho atómami a odchyľujú sa od pôvodného smeru pádu
lúč (rozptyl). Potom vstupujú do systému magnetických šošoviek, ktoré
vytvoriť na fluorescenčnej obrazovke (a na fotografickom filme) obraz vnútorného priestoru
štruktúra objektu. V tomto prípade je možné dosiahnuť rozlíšenie rádovo 0,1 nm, čo
zodpovedá zväčšeniam do 1,5×106.
Rozlíšenie a informačný obsah TEM obrázkov sú do značnej miery určené
charakteristika objektu a spôsob jeho prípravy. Ak chcete získať kontrast
obrázky aplikujú ultratenké rezy (nie viac ako 0,01 µm), spracované
zlúčeniny ťažkých kovov (impregnácia soľami olova, uránu, osmia atď.),
selektívne interagujúce so zložkami mikroštruktúry (chem
kontrast). Navyše, čím väčšia je rozptylová sila
časť skúmaného objektu (plochy so zvýšenou hustotou, zvýšenou hrúbkou a
atď.), tým tmavší bude jeho obraz.
príklady spätného indexu

Rastrovacia (rastrová) elektrónová mikroskopia

Princíp činnosti rastrovacieho elektrónového mikroskopu (SEM) je
skenovanie povrchu vzorky fokusovaným elektrónovým lúčom a analýza
častice odrazené od nej a röntgenového žiarenia vyplývajúce z
interakcie elektrónov s hmotou.
V SEM je elektrónový lúč (elektronická sonda) zaostrený elektromagneticky
kondenzorové a objektívové šošovky. Špeciálne zariadenie - deflektor vychyľuje
elektrónový lúč (primárne elektróny), ktorý kĺže po povrchu (raster).
Sekundárne elektróny (odrazené od povrchu) sú vnímané detektorom a
sú zamerané na obrazovku SEM a vytvárajú jej trojrozmerný obraz.
Moderný SEM umožňuje pracovať v širokom rozsahu zväčšení
približne od x10 (čo zodpovedá zväčšeniu silného manuálneho objektívu)
až x1 000 000, čo je asi 500-násobok hranice tých najlepších
optické mikroskopy.
Skenovacia plocha musí byť nastriekaná kovom: platina, zlato,
paládium atď.
príklady spätného indexu

Elektrónová mikroskopia (príklady)

prenos
skenovanie
.
.
.
Erytrocyty v arteriole
.
.
.
žírna bunka
späť
erytrocyt,
doštička,
leukocytov
obsah
ďalej1. Histológia, cytológia a embryológia: učebnica. / Ed. Yu.A. Afanasjev,
S.L. Kuznetsova, N.A. Yurina. – M.: Medicína, 2006. – 768 s.
2. Histológia, embryológia, cytológia: Učebnica. /
Yu.A. Chelysheva. - M.: "GEOTAR-Media", 2007. - 408 s.
Pod
vyd.
E.G. Ulumbeková,
3. Junqueira L.K., Carneiro J. Histológia: Atlas: Uch.poz.; za. z angličtiny, vyd. V.L.
Bykov. - M.: "GEOTAR-Media", 2009. - 576 s.
4. Ham A., Cormac D. Histológia: v 5 zväzkoch; za. z angličtiny. – M.: Mir, 1982.
späť
obsah

MINISTERSTVO ŠKOLSTVA A VEDY RUSKEJ FEDERÁCIE

FGBOU HPE "ŠTÁTNA UNIVERZITA SACHALIN"

PRÍRODOVEDECKÁ FAKULTA

KATEDRA EKOLÓGIE A MANAŽMENTU PRÍRODY

TEST

v odbore „Histológia a embryológia rýb

na tému "Výskumné metódy v histológii"

študent 2. ročníka

Terekhov Stepan Sergejevič

Vedecký riaditeľ,

čl. Prednášajúci Katedry ekológie a manažmentu prírody

A.V. Bojko

Južno-Sachalinsk

Úvod

Histológia je veda o organizácii, funkciách a vývoji tkanív a tkanivovej štruktúre orgánov. Hlavným predmetom štúdia histológie sú tkanivá, ktoré sú fylogeneticky tvorené, topograficky a funkčne príbuzné bunkové systémy a ich deriváty, z ktorých sa tvoria orgány. Aby ľudstvo pochopilo, ako to všetko funguje a funguje, muselo prejsť veľa, počnúc objektívmi Anthonyho Vanna Leeuwenhoeka, keď sa začalo so štúdiom všetkého živého, čo predtým nebolo vidieť. Medzi moderné metódy štúdia patrí tá hlavná, mikroskopia.

Cieľ práce: Zvážiť výskumné metódy v histológii, naučiť sa pracovať s histologickými preparátmi a pochopiť proces štúdia tkanív rôznymi mikroskopickými metódami.

1. Metódy výskumu v histológii, základy

V závislosti od predmetu štúdia sa histológia delí na normálnu (študuje tkanivá zdravého tela) a patologickú (patohistológia), ktorá skúma zmeny tkanív pri chorobách a úrazoch (zvyčajne sa považuje za úsek patologickej anatómie). Vzhľadom na špecifiká objektu a metód výskumu sa rozlišuje neurohistológia, ako aj doktrína krvi a hematopoézy, ktorá sa stala teoretický základ hematológie. Okrem toho existuje v histológii množstvo oblastí – deskriptívna histológia (popis tkanív), komparatívna histológia (porovnávanie tkanív rôzne druhy zvierat), evolučná histológia (vzorce vývoja tkaniva vo fylogenéze), ekologická histológia (študuje tkanivá v súvislosti s vplyvom podmienok prostredia), experimentálna histológia. V histológii sa používajú početné metódy výskumu - mikroskopia, experiment, tkanivové kultúry (Afanasiev 1989).

Hlavným predmetom štúdia histológie sú bunkové komplexy, ktoré tvoria tkanivá, v ich vzájomnej interakcii as intermediárnymi prostrediami. Histológia, ktorá je súčasťou morfológie, úzko súvisí s cytológiou, anatómiou a embryológiou. Metodologickým základom histológie je bunková teória a evolučná doktrína. Histológia sa zvyčajne delí na všeobecnú (študuje všeobecné zákonitosti vývoja, stavby a funkcie tkanív) a súkromnú (študuje mikroskopickú stavbu jednotlivých orgánov a telesných systémov). Špeciálne sekcie histológie sú histochémia (chémia tkanív) a histofyziológia (mechanizmy aktivity tkaniva) (Yushkantseva 2006).

2. Metódy výskumu

Metódy výskumu v histológii zahŕňajú prípravu histologických preparátov s ich následným štúdiom pomocou svetelného alebo elektrónového mikroskopu. Histologické preparáty sú stery, odtlačky orgánov, tenké rezy kúskov orgánov, prípadne zafarbené špeciálnym farbivom, umiestnené na podložnom sklíčku mikroskopu, uzavreté v konzervačnom médiu a prekryté krycím sklíčkom.

V modernej histológii, cytológii a embryológii sa používajú rôzne výskumné metódy na komplexné štúdium procesov vývoja, štruktúry a funkcie buniek, tkanív a orgánov.

Hlavnými fázami histologickej analýzy sú výber predmetu štúdie, jeho príprava na vyšetrenie pod mikroskopom, použitie mikroskopických metód, ako aj kvalitatívna a kvantitatívna analýza obrázkov.

Predmetom štúdia sú živé a mŕtve (fixované) bunky a tkanivá a ich obrazy získané vo svetelných a elektrónových mikroskopoch.

Hlavným predmetom štúdia sú histologické preparáty pripravené z fixných štruktúr. Liekom môže byť náter (napríklad náter krvi, kostnej drene, slín, mozgovomiechového moku atď.), odtlačok (napríklad sleziny, týmusu, pečene), film tkaniva (napr. spojivové alebo peritoneálne, pleura, pia mater), tenký rez. Najčastejšie sa na štúdium používa časť tkaniva alebo orgánu. Histologické preparáty je možné študovať bez špeciálneho spracovania. Napríklad pripravený krvný náter, výtlačok, film alebo časť orgánu je možné okamžite vidieť pod mikroskopom. Ale vzhľadom na to, že štruktúry majú slabý kontrast, sú v bežnom svetelnom mikroskope zle detekované a je potrebné použitie špeciálnych mikroskopov (fázový kontrast atď.). Preto sa častejšie používajú špeciálne spracované prípravky: fixované, uzavreté v pevnom médiu a farbené (Yurina 1999).

Proces výroby histologického preparátu pre svetelnú a elektrónovú mikroskopiu zahŕňa tieto hlavné kroky:

odoberanie materiálu a jeho upevnenie,

zhutnenie materiálu,

príprava na rezanie,

farbenie alebo kontrastné časti.

Pre svetelnú mikroskopiu je potrebný ešte jeden krok - uzatváranie rezov v balzame alebo inom priehľadnom médiu.

Fixácia zaisťuje prevenciu rozkladných procesov, čo pomáha zachovať celistvosť štruktúr. Dosahuje sa to tak, že malá vzorka odobratá z orgánu sa buď ponorí do fixačného prostriedku (alkohol, formalín, roztoky solí ťažkých kovov, kyselina osminová, špeciálne fixačné zmesi), alebo sa podrobí tepelnému spracovaniu. Pôsobením fixačného prostriedku dochádza v tkanivách a orgánoch k zložitým fyzikálno-chemickým zmenám. Najvýznamnejším z nich je proces ireverzibilnej koagulácie proteínov, v dôsledku čoho prestáva životne dôležitá aktivita a štruktúry sú mŕtve, fixované. Fixácia vedie k zhutneniu a zmenšeniu objemu kusov, ako aj k zlepšeniu následného farbenia buniek a tkanív.

Zhutňovanie materiálu potrebné na prípravu rezov sa uskutočňuje impregnáciou predtým dehydratovaného materiálu parafínom, celoidínom a organickými živicami. Rýchlejšie zhutnenie sa dosiahne použitím metódy zmrazenia kusov, napríklad v tekutej kyseline uhličitej.

Rezy sa pripravujú na špeciálnych prístrojoch - mikrotómy (pre svetelnú mikroskopiu) a ultramikrotómy (pre elektrónovú mikroskopiu).

Farbenie rezov (vo svetelnej mikroskopii) alebo ich postriekanie soľami kovov (v elektrónovej mikroskopii) sa používa na zvýšenie kontrastu obrazu jednotlivých štruktúr pri pohľade pod mikroskopom. Metódy farbenia histologických štruktúr sú veľmi rôznorodé a vyberajú sa v závislosti od cieľov štúdie.

Histologické škvrny (podľa ich chemickej povahy) sa delia na kyslé, zásadité a neutrálne. Príkladom je najčastejšie používané farbivo hematoxylín, ktorý farbí jadrá buniek do fialova, a kyslé farbivo eozín, ktoré farbí cytoplazmu do ružovo-žlta. Selektívna afinita štruktúr k určitým farbivám je spôsobená ich chemickým zložením a fyzikálnymi vlastnosťami. Štruktúry, ktoré sa dobre farbia kyslými farbivami, sa nazývajú oxyfilné a tie, ktoré sa farbia zásaditými farbivami, sa nazývajú bazofilné. Napríklad cytoplazma buniek sa najčastejšie farbí oxyfilne a jadrá buniek sa farbia bazofilne.

Štruktúry, ktoré prijímajú kyslé aj zásadité farbivá, sú neutrofilné (heterofilné). Farebné prípravky sa zvyčajne dehydratujú v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou a vyčistia sa v xyléne, benzéne, toluéne alebo niektorých olejoch. Pre dlhodobú konzerváciu sa dehydrovaný histologický rez vloží medzi sklíčko a krycie sklíčko do kanadského balzamu alebo iných látok. Hotový histologický preparát je možné používať na mikroskopické vyšetrenie mnoho rokov (Yurina, Radostina 1999).

V elektrónovej mikroskopii sa rezy získané na ultramikrotóme umiestnia na špeciálne mriežky, kontrastujú so soľami uránu, olova a iných kovov, potom sa prezerajú pod mikroskopom a fotografujú. Získané mikrofotografie slúžia ako predmet štúdia spolu s histologickými preparátmi.

3. Metódy mikroskopie histologických preparátov

Mikroskopia môže byť svetelná (pomocou svetelného mikroskopu) a elektrónová (pomocou elektrónového mikroskopu). Svetelná mikroskopia sa môže vykonávať v prechádzajúcom svetle, keď svetlo prechádza tenkým priehľadným histologickým preparátom, alebo v odrazenom svetle, keď sa skúma napríklad hrubý alebo nepriehľadný predmet. Podobne môže byť elektrónová mikroskopia transmisná, kedy elektrónový lúč prechádza skúmaným ultratenkým rezom, alebo rastrová či skenovacia, kedy sa elektrónový lúč odráža od povrchu skúmaného objektu. V prvom prípade sa elektrónový mikroskop nazýva transmisia (TEM) a v druhom - skenovanie (SEM).

1 Svetelná mikroskopia

Mikroskopia, hlavná metóda na štúdium preparátov, sa v biológii používa už viac ako 300 rokov. Moderné mikroskopy sú rôzne zložité optické systémy s vysokým rozlíšením a umožňujú študovať veľmi jemné detaily štruktúry buniek a tkanív. Veľkosť najmenšej štruktúry, ktorú je možné vidieť pod mikroskopom, je určená najmenšou rozlíšiteľnou vzdialenosťou (d0). Závisí to hlavne od vlnovej dĺžky svetla. ?, a táto závislosť je približne vyjadrená vzorcom d0 = ? / 2. Čím je teda vlnová dĺžka svetla kratšia, tým je rozlíšiteľná vzdialenosť menšia a v preparáte je možné vidieť menšie štruktúry (t. j. čím vyššie je „rozlíšenie“ mikroskopu). Pojem "zväčšenie mikroskopu" sa týka jeho optického systému a je vyjadrený ako súčin zväčšení objektívu a okuláru. „Rozlíšenie“ mikroskopu však závisí od vlastností objektívu a je nezávislé od okuláru.

Na štúdium histologických preparátov sa častejšie používajú klasické svetelné mikroskopy rôznych značiek, kedy sa ako zdroj osvetlenia používa prirodzené alebo umelé svetlo. Minimálna vlnová dĺžka viditeľnej časti svetelného spektra zodpovedá asi 0,4 µm (fialové spektrum). Preto je pre konvenčný svetelný mikroskop rozlišovacia vzdialenosť približne 0,2 µm a celkové zväčšenie (objektívne zväčšenie krát zväčšenie okuláru) dosahuje 2000-násobok.

Jednotky používané v histológii: Mikrometre sa používajú hlavne na meranie štruktúr vo svetelnej mikroskopii: 1 µm je 0,001 mm; nanometre sa používajú v elektrónovej mikroskopii: 1 nm je 0,001 mikrónu (Yushantseva 2006)

2 Ultrafialová mikroskopia

Ide o typ svetelnej mikroskopie. Ultrafialový mikroskop využíva kratšie ultrafialové lúče s vlnovou dĺžkou asi 0,2 µm. Povolená vzdialenosť je tu približne 0,1 µm. Obraz získaný v ultrafialových lúčoch, okom neviditeľný, sa mení na viditeľný registráciou na fotografickej doske alebo pomocou špeciálnych zariadení (pretože luminiscenčná obrazovka alebo elektrón-optický konvertor) (Yurina 1999)

3 Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia

Fenomén fluorescencie spočíva v tom, že atómy a molekuly množstva látok, ktoré pohlcujú krátkovlnné lúče, prechádzajú do excitovaného stavu. Spätný prechod z excitovaného stavu do normálneho stavu nastáva pri emisii svetla, ale s inou, dlhšou vlnovou dĺžkou. Vo fluorescenčnom mikroskope sa ako svetelné zdroje na excitáciu fluorescencie používajú ortuťové alebo ultravysokotlakové xenónové výbojky, ktoré majú vysoký jas v spektrálnej oblasti 0,25-0,4 μm (blízko ultrafialových lúčov) a 0,4-0,5 μm (modrofialové lúče ). Vlnová dĺžka svetelnej vlny indukovanej fluorescencie je vždy väčšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, preto sa oddeľujú pomocou svetelných filtrov a obraz objektu sa študuje len vo svetle fluorescencie. Rozlišujte medzi vlastnou alebo primárnou a indukovanou alebo sekundárnou fluorescenciou. Každá bunka živého organizmu má svoju vlastnú fluorescenciu, ale často je extrémne slabá. Sekundárna fluorescencia nastáva, keď sú prípravky ošetrené špeciálnymi farbivami - fluorochrómy<#"justify">Artishevsky, A. A. Histológia s histologickou technikou

výskum (1999)

Antipchuk, Yu.P. Histológia so základmi embryológie (1983)

Afanasiev Yu.I., Yurina N.A. - Histológia, cytológia a embryológia (1989) "Medicína"

Afanasiev Yu.I., Yurina N.A. - Histológia, cytológia a embryológia (2002) "Medicína"

Bykov V.L. Súkromná ľudská histológia "Sothis" 1999

Zavarzin A.A., Stroeva O.G. - Porovnávacia histológia. Učebnica "SPB" 2000

Kuznecov S.L., Mushkambarov N.N. - Atlas histológie, cytológie a embryológie "MIA" 2002

Ryabov, K. P. Histológia so základmi embryológie: tutoriál (1990)

Ulumbekov E.G., Chelyshev Yu.A. - Histológia. Učebnica pre vysoké školy (1997) "Geotar" 1997

Čelyšev Yu.A. - Grafické testy z histológie, cytológie, embryológie "KSMU" 2000

Yurina N.A., Radostina A.I. - Workshop o histológii, cytológii a embryológii "UDN" 1999

Yushkantseva S.I., Bykov V.L. - Histológia, cytológia a embryológia. Stručný atlas "P-2" 2006

Doučovanie

Potrebujete pomôcť s učením témy?

Naši odborníci vám poradia alebo poskytnú doučovacie služby na témy, ktoré vás zaujímajú.
Odoslať žiadosť s uvedením témy práve teraz, aby ste sa dozvedeli o možnosti konzultácie.